禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）

【產(chǎn)品概述】

禽流.感病毒H5亞型屬于高致病性禽.流感病毒，對禽類危害巨大,甚至會感染人類，如H5N1禽.流感為衛(wèi)生部傳染病防治法中的法定傳染病，屬人感染高致病性禽.流感。

 禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）應(yīng)用RT-PCR熒光探針法，快速、準確地定性檢測具流感癥狀的人群或禽類動物的唾液或分泌物等樣本中的H5亞型禽.流感病毒核酸，適用于該亞型病毒的檢測、輔助診斷和流行病學調(diào)查等。

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

【禽流.感病毒H5亞型核酸熒光PCR檢測試劑盒適用儀器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運輸：采用冰盒加冰密封進行運輸。

【自備試劑】

核酸提.取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

【   禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）使用方法】

注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關(guān)說明書；陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)）

取N個（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，每管分別加入H5 RT-PCR反應(yīng)液19 μl、RT-PCR酶1 μl (也可根據(jù)每人份用量計算N+1份H5 RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應(yīng)管)

將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

      3. 加樣（樣本處理區(qū)）

在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。

   * 注意事項：建議加樣順序是陰性質(zhì)控品、待檢樣本、陽性質(zhì)控品。

      4. PCR擴增（擴增區(qū)）

1)      儀器設(shè)置（以ABI Prism 7500為例）

   將PCR反應(yīng)管放入PCR儀內(nèi)，按照對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品(NTC)、陽性質(zhì)控品(Standard)及待檢樣本(Unknown)。Reporter Dye為FAM，Quencher Dye為None，參比染料(Passive Reference)為 None。

1)      擴增程序

50℃ 10min

95℃ 3min

        95℃ 10sec

60℃ 1min

60℃采集熒光信號，反應(yīng)體系為25 μl。

禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）結(jié)果分析條件設(shè)定

u 基線（Baseline）設(shè)定：應(yīng)選擇該次實驗指數(shù)擴增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（Start）應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（End）應(yīng)比早出現(xiàn)指數(shù)擴增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán)，建議基線設(shè)為6~15。

u 閾值(Threshold)設(shè)定：將閾值線設(shè)定在剛好超過正常陰性質(zhì)控品擴增曲線的*點。

【質(zhì)控標準】

1.   陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，無指數(shù)擴增期，Ct=40或無Ct；

2.   陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性，有明顯的指數(shù)擴增期，Ct值應(yīng)小于等于35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。

【   禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）結(jié)果判斷】

1.   陽性：有明顯的指數(shù)擴增期，且Ct＜38；

2.   可疑：有明顯的指數(shù)擴增期，且38≤Ct<40，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復(fù)核一次，若復(fù)核結(jié)果Ct<40且有指數(shù)擴增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；

3.   陰性：無指數(shù)擴增期，Ct=40或無Ct值均判定為陰性樣本。

【對檢驗結(jié)果的解釋】

1.   實驗室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

2.   試劑運輸、保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，可能會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

【   禽流.感病毒H5亞型檢測試劑盒（PCR法）使用注意事項】

1.   有關(guān)實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2.   本試劑盒僅用于體外檢測。

3.   實驗請嚴格分區(qū)操作：

第1區(qū)：PCR前準備區(qū) — 準備擴增所需試劑；

第二區(qū)：樣本處理區(qū) — 待測樣本和對照品處理；

第三區(qū)：檢測區(qū) — PCR擴增檢測。

4.   各區(qū)物品均為，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺；

5.   試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。

6.   在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。

7.   分裝有反應(yīng)液的檢測板或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。

8.   加樣時應(yīng)使樣品*落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快封上封板膜。

9.   擴增完畢立即取出檢測板，密封在塑料袋內(nèi)，丟棄于地點。

10.   反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

11.   實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12.   工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。

13.   建議使用離心管和吸頭一覽表