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古典豬瘟病毒通用型試劑盒

產(chǎn)品型號(hào):

廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家

訪問(wèn)量:1267

更新時(shí)間:2022-11-09

簡(jiǎn)要描述:

?古典豬瘟病毒通用型試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)?

本試劑盒針對(duì)古典豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含古典豬瘟病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

詳細(xì)說(shuō)明:

古典豬瘟病毒通用型試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名稱(chēng): 古典豬瘟病毒通用型試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)


【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于古典豬瘟病毒檢測(cè),可用于臨床古典豬瘟病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。

【檢驗(yàn)原理】

古典豬瘟病毒通用型試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)

本試劑盒針對(duì)古典豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含古典豬瘟病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號(hào)

組成

25T/盒

50T/盒

1

CSFV RT-PCR反應(yīng)液

375 μL×1管

750 μL×1管

2

CSFV逆轉(zhuǎn)錄酶

50 μL×1管

100 μL×1管

3

CSFV Taq酶

75 μL×1管

150 μL×1管

4

CSFV陽(yáng)性對(duì)照

40 μL×1管

40 μL×1管

5

CSFV陰性對(duì)照

40 μL×1管

40 μL×1管

6

說(shuō)明書(shū)

1份

1份

注:陰性對(duì)照為豬基因組DNA,陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的古典豬瘟病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品:使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

2.肌肉或內(nèi)臟樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中,3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于2~8冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

(2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應(yīng)液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

2.0 μL

Taq酶

3.0 μL

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集古典豬瘟病毒熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

   42℃:10分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃:5秒(s)

5

55℃:40秒(s)

PCR擴(kuò)增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

(1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

(1)陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

(2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

(3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

陽(yáng)性(+)

標(biāo)本中檢出古典豬瘟病毒RNA

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出古典豬瘟病毒RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

  • 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

  • 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

  • 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

  • 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

  • 為避免RNA降解,樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè);樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。

  • 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。

  • 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心。

  • 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。

  • 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

  • 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號(hào)試劑不能混用。

  • ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

  • 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。





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